与赵世炎、罗亦农、陈延年、李立三、尹宽联名致中央，主张迅速师讨伐蒋介石。电报中分析了军事力量对比，认为蒋介石于不利地位。“为全局计，政治不宜再缓和妥协”。但这一建议未为苏联顾问鲍罗廷和陈独秀所采纳。

1927年5月下旬，周恩来由上海秘密到达中央所在地武汉。此前，在汉召开的第五次全国代表大会上，周恩来被选为中央委员；在五届一中全会上，又被选为中央政治局委员。25日，中央政治局常委会议决定周恩来任中央军事长，必要时参加常委会议。29日，中央政治局常委会议决定周恩来代理中央常委职务，参加中央心领导。从此以后，在长达半个世纪的时间内，周恩来一直是中央的主要领导人之一。

周恩来领导军事后，以聂荣臻、王一飞、颜昌颐、欧钦等为助手，行了对军队的组织、联络，加了军队的政治工作，向国民革命军中派去朱德、陈毅、刘伯承等不少，并负责指导武汉的工人纠察队和湖南、广东的农民运动。这时，国民革命军独立第十四师师长夏斗寅在宜昌发动的武装叛变虽已击退，长沙许克祥又发动了反革命的“日事变”，武汉汪卫叛变革命的迹象越来越明显，周恩来主张在农民运动力量大的湖南农村发动武装起义。6月17日，他在中央常委会上提，现在湖南18县有8000枝枪，可以派人去集中起来，攻取反动力量弱的城池，计划取湘潭，集中浏、平江，省委下设军委，各区设农军委员会，在可能范围内成立乡村的临时委员会，对许多反动军队则扰之，弱则缴其械。会议同意了这一布置。20日，周恩来在中央常委会上又说：湖南省委决定派50人回去，把湖南划为10个区，派10名懂军事的去，作好准备，据政治局决定行暴动。但这些意见遭到共产国际代表的反对，没有实现，陈独秀在7月5日的中央常委会上甚至说：军事工作应该收缩。

7月15日，汪卫背叛孙中山的国共合作政策。他同蒋介石一样，对员和革命群众行大屠杀。

中国决定举行南昌起义。

南昌起义的建议最早是谁提来的？是周恩来。周恩来讲过这个过程，南昌起义的提是这样的：“那时，军委想可否搞个起义，主要是鲍罗廷跟加说可以搞个起义，国际决定上没有。”而周恩来当时正是军委领导人。这时间是在7月中旬。据这个考虑，周恩来向在军委工作的几个同志布置，指定贺昌、颜昌颐、聂荣臻组成前敌军委，聂荣臻为书记，任务是先到九江去，通知同志们了解这个意图，作为起义的准备。什么时候发难，要听中央的命令。

7月26日，周恩来由陈赓陪同到九江，27日到南昌。当时，临时中央常委会议已经正式决定，成立由周恩来、李立三、恽代英、彭湃组成的前敌委员会，周恩来为前委书记，用国民党革命委员会的名义在南昌举行武装起义。

8月1日凌晨，周恩来和贺龙、叶、朱德、刘伯承等领导在中国掌握和影响下的国民革命军2万余人举行起义。经过几个小时的激烈战斗，全歼驻南昌国民党军3000余人，于拂晓占领南昌。

南昌起义开始了中国独立地领导革命武装斗争和创建人民革命军队的新时期。从此，8月1日成为中国领导下的革命军队的光荣节日。1933年6月30日，中央革命军事委员会决定以南昌起义的8月1日为中国工农红军成立纪念日，中华苏维埃共和国临时中央政府批准这个决定。中华人民共和国成立后，确定8月1日为建军节。

起义胜利后，周恩来席在原江西省政府召开的有中国人和国民党左派人士参加的联席会议。会议选宋庆龄、邓演达、何香凝等25人组成中国国民党革命委员会。周恩来当选为委员，并被任命为参谋团委员。